对于逆转录，大家都知道它是以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成互补DNA (complementary DNA，cDNA)的过程（如图1）。但对于过程中起关键作用的逆转录酶，可能比较陌生。接下来，让小翌给大家介绍下逆转录酶的相关理论知识。
图1. 逆转录过程示意图
逆转录酶的发现
1970年美国科学家Howard Temin和David Baltimore分别在动物致癌RNA病毒中发现了逆转录酶，并因此获得了1975年诺贝尔生理学或医学奖。该发现揭示了生物体的遗传信息不仅可以从DNA到DNA（DNA自我复制）、从RNA到RNA、从DNA到RNA（转录），还可以从RNA到DNA(逆转录)，进而补全了中心法则（如图2）。
图2. 中心法则示意图
逆转录酶的酶学特性
逆转录酶属于DNA聚合酶的一类，可以聚合dNTP合成cDNA链，这一过程的发生，依赖于逆转录酶的2大活性：DNA聚合酶活性和RNase H活性。
DNA聚合酶活性：以RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA的3′末端以5′→3′方向合成DNA。值得注意的是该酶不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，会导致DNA出错率比较高。
RNase H活性：DNA链容易与RNA链形成DNA-RNA杂交链，RNase H可以水解杂交链上的RNA。它是病毒生命周期中复制循坏所必需的，能限制逆转录酶的合成长度。
逆转录酶的种类
目前，市面上常用的两种逆转录酶：AMV和M-MLV。它们拥有着不同的特征，如表1所示。
表1. M-MLV和AMV逆转录酶的特征比较
M-MLV
AMV
来源
莫洛尼鼠白血病病毒
禽成髓细胞瘤病毒
热稳定性
差，37-42℃
好，42-55℃
最适pH
7.6
8.3
RNase H活性
弱
强
cDNA合成得率
较高
低
合成长度
长，可达2-3kb
短
对抗复杂结构RNA的能力
弱
强
优势
合成产物长度长、含量高
比M-MLV更耐热，适合具有一定复杂结构的RNA转录
虽然野生型M-MLV逆转录酶的热稳定性差，抵抗复杂结构的RNA能力弱，但通过对其进行改造可弥补这些不足。渐渐地，改造后的M-MLV逆转录酶成为了市场的主流产品。
翌圣Hifair®逆转录酶
为了提高M-MLV的逆转录能力，翌圣生物在野生型M-MLV的基础上通过基因工程技术开发出了Hifair®系列逆转录酶，包括Hifair®Ⅱ和Hifair®Ⅲ系列逆转录酶。
其中Hifair®Ⅲ系列逆转录酶cDNA合成速度快，且热稳定性高，可耐受高达60℃的反应温度，非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。该酶缺失了RNaseH活性，提高了其延伸能力，其合成长度达19.8kb。此外，该酶增强了与模板的亲和力，非常适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。
产品选择指南
产品形式
产品名称和编号
引物
适用实验类型
产品特点
单酶
Hifair® II Reverse Transcriptase /11110ES
无
PCR/qPCR
A.逆转录条件：42℃,30min
总RNA使用范围：1ng-5μg
合成cDNA长度：10kb
Hifair® III Reverse Transcriptase/11111ES
B.逆转录条件：55℃,15min
总RNA使用范围：10pg-5μg
合成cDNA长度：19.8kb
酶和buffer 分开
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11119ES
Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)/11121ES
单独成管的oligodT、
random primer
PCR/qPCR
同A
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit/11139ES
同B
酶和buffer预混
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11120ES
Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)/11123ES
按比例预混的oligodT、
random primer
qPCR
C.逆转录条件：42℃,30min
总RNA使用范围:1ng-5μg
2×预混液
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR/11141ES
D.逆转录条件：55℃,15min
总RNA使用范围：10pg-5μg
4×预混液，可投入更大体积模板
Hifair®Ⅲ逆转录酶性能展示
◎ 可耐受60℃反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录
图3. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)在42℃-65℃下进行逆转录。取1μL cDNA为模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat NO.10148ES)扩增TFRC基因（4.4kb）。M:1kb DNA ladder.
◎ 优越的延伸性能，可合成19.8kb的cDNA
图4. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板，oligodT为引物，使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)合成cDNA。取1μL cDNA为模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)扩增DY1C1N1基因（19.9kb）的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.
◎ 出色的逆转录效率，适合不同 GC 含量、不同表达丰度的基因
图5. 以300ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)、T品牌合成cDNA。取1μL cDNA为模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增20个不同GC含量（25-65%）、不同表达丰度的基因。
◎ 线性检测范围广，Total RNA 10pg-5μg
图6.以10pg-5μg的293T细胞的总RNA为模板，使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)合成cDNA。取1μL cDNA为模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增PTTG1基因。
相关产品
产品定位
产品名称
货号
规格
单酶
Hifair® II Reverse Transcriptase
11110ES92/93
1/5×10KU
高灵敏度单酶
Hifair® III Reverse Transcriptase
11111ES92/93
1/5×10KU
Kit
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit
11119ES60
100T
Kit(含gDNA去除步骤)
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)
11121ES60
100T
高灵敏Kit（含gDNA去除步骤）
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)
11139ES60
100T
预混液
Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix
11120ES60
100T
预混液（含gDNA去除步骤）
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)
11123ES60
100T
高灵敏预混液（含gDNA去除步骤）
Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)
11141ES60
100T
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已发表文献（部分）
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以上是小翌本期给大家分享的内容，主要介绍了逆转录酶的发现、酶学特性和种类。下期，我们将告诉大家应如何正确选择逆转录引物，我们下期不见不散哦~